Схемы действия ферментов рестриктазы EcoR I и Hae III на двухцепочечную молекулу ДНК. Получение гибридных молекул ДНК


Задача 60. 
Имеется последовательность из 42 нуклеотидных пар двухцепочечной ДНК следующего состава:
 5`-ЦЦТТАГГЦЦТГААТТААГГЦААТАГТГТГААТТЦАЦАТГААА-3`
 3`-ГГААТЦЦГГАЦТТААТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТААГТГТАЦТТТ-5`
Каким способом и на сколько частей можно разрезать эту ДНК?
Решение
В данной последовательности ДНК имеется два участка распознавания: (ГААТТЦ) для рестриктазы EcoR I и (ГГЦЦ) для Hae III

днк


Поэтому искомая ДНК может быть разрезана в двух местах с образованием трех различных фрагментов следующих последовательностей:

днк
 


Задача 61.
Ниже приведены последовательности двух фрагментов ДНК выделенных из организмов разных видов:  ГААТТЦ
1) 5`-АГЦАТАЦТГТГААТТЦАЦА-3` 2) 5`-АТГААТТЦТТАГЦАТАЦ-3`
    3`-ТЦГТАТГАЦАЦТТААГТГТ-5`    3`-ТАЦТТААГААТЦГТАТГ-5`
С помощью каких ферментов можно получить гибридную молекулу ДНК из этих фрагментов? Опишите последовательные этапы получения гибридной молекулы.
Решение: 
На первом этапе необходимо разрезать представленные фрагменты ДНК разных видов с помощью подходящих рестрикционных ферментов. В данном случае можно использовать рестриктазу EcoR I (участок распознавания (ГААТТЦ), которая расщепит ДНК двух видов на четыре новых фрагмента 1а), 1б) и 2а), 2б) с липкими концами ААТТ и ТТАА:

 

днк

В ходе второго этапа необходимо смешать нужные нам фрагменты 1а) и 2б). В результате выступающие липкие концы скрепятся между собой, как им и положено, водородными связями в силу комплементарности:

днк

Окончательное скрепление фрагментов 1а) и 2б) двух молекул ДНК производит специализированный фермент ДНК-лигаза, которая «сшивает» между собой сахарофосфатные остовы обоих фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК.

Очевидно, что по такому же механизму произойдет и скрепление фрагментов 2а) и 1б) молекул ДНК, получим:

днк
 


Задача 62.
Гаплоидный геном человека содержит около 3.109 нуклеотидных пар (н.п.) ДНК. Если вы порежете человеческую ДНК рестрикционным ферментом Hae III, узнающим тетрамерную последовательность (ГГЦЦ), то сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено.
Решение:
Исходя из предположения, что четыре нуклеотида А, Т, Г, Ц находятся в равных количествах и распределяются в ДНК случайным образом вероятность для любого из четырех нуклеотидов занять конкретное место в цепочке составляет 1/4. Вероятность для двух нуклеотидов (например, Ц и Г) занять конкретное место составит (1/4 . 1/4) = (1/4)2, а вероятность для специфической тетрамерной последовательности будет равна (1/4)4 = (1/256). Следовательно, Hae III будет разрезать молекулу человеческой ДНК в среднем один раз на 256 нуклеотидных пар. Если молекула ДНК разрежется (n) раз, то в результате получается (n+1) фрагмент. Гаплоидный геном из 3 .109  нуклеотидных пар содержит около 11718750 [(3 . 109)/256] мест разреза для рестриктазы Hae III. Если бы полный геном человеческой ДНК состоял из одной молекулы, то Hae III могла бы разрезать его на (732 422 + 1) фрагмент. Но поскольку места разрезания распределены по 23 хромосомам, то в результате полного расщепления человеческой ДНК рестриктазой Hae III должно получиться (11718750 + 23) рестрикционных фрагмента.